百日咳是一種由百日咳桿菌引起的急性呼吸道感染,早期診斷對(duì)于百日咳的治療至關(guān)重要。目前,實(shí)驗(yàn)室診斷百日咳常用的方法有:培養(yǎng)法、直接熒光抗體檢測(cè)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、配對(duì)及單一血清學(xué)技術(shù)。通過培養(yǎng)分離百日咳桿菌是診斷百日咳的傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”,具有大約100%的特異性。然而,基于培養(yǎng)的方法的靈敏度很差,在12% ~ 60%之間,而且這些方法非常耗時(shí),平均需要5天。
傳統(tǒng)的PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)方法是核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),自20世紀(jì)90年代以來(lái),PCR已被用作臨床和非臨床研究環(huán)境中百日咳的診斷工具。然而,PCR技術(shù)需要專業(yè)的人員和設(shè)備基礎(chǔ)設(shè)施,并且從采樣到結(jié)果的時(shí)間也很長(zhǎng),不適合簡(jiǎn)單快速的即時(shí)檢測(cè)(POC)。核酸等溫檢測(cè)技術(shù),如重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、重組酶輔助擴(kuò)增(RAA)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等,具有操作簡(jiǎn)單、恒溫、快速等優(yōu)點(diǎn),在POC中具有很大的潛力。令人沮喪的是,它們的應(yīng)用受到限制,因?yàn)榕cqPCR相比,它們的靈敏度較低,而且可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
近年來(lái),基于CRISPR/Cas的核酸檢測(cè)方法已廣泛運(yùn)用于分子診斷。將CRISPR/Cas核酸酶蛋白與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)了一系列不需要特殊精密儀器的簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可視化的核酸檢測(cè)方法。例如,基于Cas13a或Cas13b的SHERLOCK核酸檢測(cè)平臺(tái),基于Cas12a的DETECTR檢測(cè)技術(shù),以及基于Cas12b的CDetection的檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)核酸的快速檢測(cè)。然而,這些方法需要兩個(gè)步驟,首先擴(kuò)增目標(biāo)序列,然后進(jìn)行CRISPR檢測(cè)。這樣的多個(gè)處理步驟增加了操作時(shí)間和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
STOPCovid (SHERLOCK Testing in One Pot)和STOPCovid v2在開發(fā)耐熱型嗜酸芽孢桿菌Cas12b (AapCas12b)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了RT-LAMP來(lái)解決兩步法的問題。但是,這些基于LAMP的一鍋檢測(cè)需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間,反應(yīng)溫度為60℃,這限制了LAMP的引物設(shè)計(jì),而且溫度高容易造成燒傷,不適合在家庭等場(chǎng)所進(jìn)行檢測(cè)。李博安團(tuán)隊(duì)在之前的研究中發(fā)現(xiàn),CRISPR-Cas蛋白的低順式裂解活性和高反式裂解活性是結(jié)合核酸擴(kuò)增一步檢測(cè)的關(guān)鍵,開發(fā)了一種不受PAM限制的一步法核酸檢測(cè)技術(shù)。近期,研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在較低溫度下,AacCas12b仍保持較高的反式裂解活性,而順式裂解活性極弱,在此基礎(chǔ)上建立了RAA-CRISPR/Cas12b單鍋檢測(cè)(Rcod)系統(tǒng)。該研究成果以題為“Rapid and sensitive detection of nucleic acids using an RAA-CRISPR/Cas12b one-pot detection assay (Rcod)”的研究論文在線發(fā)表于Talanta。
該研究發(fā)現(xiàn)AacCas12b在30?C~39?C溫度范圍內(nèi)仍然具有較高的反式裂解活性,和較低的順式裂解活性,使得AacCas12b和較低溫度的等溫?cái)U(kuò)增(如RAA)建立一鍋法成為可能。在Rcod體系中,AacCas12b的裂解和等溫?cái)U(kuò)增同時(shí)發(fā)生在一個(gè)試管中,具有高反式裂解活性和低順式裂解活性的AacCas12b對(duì)體系中核酸的干擾弱于具有高順式裂解活性的AacCas12b,展現(xiàn)出較高的靈敏度和可靠性。
與傳統(tǒng)的基于CRISPR的檢測(cè)方法相比,直接在一管中進(jìn)行RAA擴(kuò)增和AacCas12b切割的系統(tǒng)更方便實(shí)現(xiàn),避免了兩步法的繁瑣操作。與其他Cas12b一步檢測(cè)方法相比,Rcod系統(tǒng)具有靈敏度高(0.2 copies/μL)、耗時(shí)短(30 min以內(nèi))的優(yōu)點(diǎn)。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比,Rcod聯(lián)合無(wú)核酸提取法在30 min內(nèi)對(duì)221份臨床標(biāo)本進(jìn)行百日咳檢測(cè),靈敏度為97.96%,特異性為99.19%,準(zhǔn)確率為98.64%。總之,Rcod系統(tǒng)是一種一步、簡(jiǎn)單、快速的核酸檢測(cè)方法,具有較高的靈敏度和特異性,為POC的診斷提供了一種快速的診斷方法。
該論文的第一作者為廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生林康鳳,國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心姚開虎教授以及廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士生李簫和李清涵為本文的共同第一作者,廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授、廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院李志勇教授和廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊曉慶教授為該文章的共同通訊作者。