單核苷酸多態(tài)性(SNP)涉及一個堿基的差異,具有重要的臨床意義。同一種疾病的患者服用相同的藥物時,可能會出現(xiàn)不同的反應(yīng),藥物分為顯效、有效、無效。一個SNP就可能改變蛋白的表達(dá),從而改變藥物的靶位點,使其親和力降低或缺乏。因此,SNP分析有助于實現(xiàn)正確的診斷和有效治療。
一些傳統(tǒng)的檢測SNP的方法,如雙脫氧測序、焦磷酸測序、全基因組測序、qPCR等,可以揭示SNP相關(guān)重要特征,如識別SNP的類型及其準(zhǔn)確位置。但這些方法操作繁瑣,價格昂貴,不適合普遍使用。近期,研究團(tuán)隊開發(fā)了一種基于PCR擴(kuò)增結(jié)合熔解曲線分析的檢測策略,可在1管內(nèi)同時檢測3個SNP位點CYP2C19 * 2 / 3 / 17共9種基因型,并在1 h內(nèi)實現(xiàn)快速檢測,該研究成果以題為“An Extraction-Free Method for Rapid Detection of CYP2C19 * 2/3/17 Polymorphisms in One Tube using Melting Curve Analysis”的研究論文在線發(fā)表于BIOTECHNOLOGY JOURNAL。
該研究通過不對稱擴(kuò)增方式對初始模板進(jìn)行擴(kuò)增,使用相鄰探針和Taqman探針相結(jié)合的方式進(jìn)行檢測。CYP2C19 * 2探針的3 '端修飾FAM熒光基團(tuán),相鄰間隔1堿基的第二段探針的5 '端修飾BHQ1淬滅基團(tuán),3 ' 端修飾磷酸基團(tuán)P以阻斷延伸。同樣,CYP2C19 * 17的第一段探針的3' 端修飾熒光團(tuán)為ROX,第二段探針的猝滅基團(tuán)為BHQ2。在研究過程中發(fā)現(xiàn),一管中多個相鄰探針的存在會導(dǎo)致引物和探針之間的相互干擾。相鄰探針檢測的方法最終可以在一管中容納兩個多態(tài)性位點。因此,我們將Taqman探針與相鄰探針相結(jié)合。CYP2C19 * 3設(shè)計為Taqman探針:5 '端由HEX熒光團(tuán)修飾,3 '端攜帶BHQ1淬滅基團(tuán)。由于探針與模板鏈的結(jié)合力隨著溫度的升高而降低,因此出現(xiàn)了熔解峰。由于純合野生型和突變型樣品之間存在一個堿基的差異,因此在熔解階段Tm值不同,最終的檢測結(jié)果表現(xiàn)出不同的Tm值。
此外,結(jié)合樣本釋放劑,可快速提取樣本,數(shù)秒即可完成提取,同時該檢測系統(tǒng)不局限于血液樣本,還可以應(yīng)用于口咽和唾液樣本,增加了采樣的多樣性和便利性。我們同時檢測了93例臨床血液樣本,驗證了我們建立的檢測體系能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別不同基因型,并且通過Sanger測序驗證了檢測的準(zhǔn)確性和有效性?;趯崟r聚合酶擴(kuò)增結(jié)合熔解曲線分析的檢測技術(shù)因其準(zhǔn)確、快速、操作簡單、成本低等優(yōu)點,將成為檢測和指導(dǎo)氯吡格雷使用的有力工具。
該論文的第一作者為廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生郭劍光,博士生尤偉鑫為本文的共同第一作者,廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授和廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院張睿博士為該文章的共同通訊作者。本項目得到國家重點研發(fā)計劃(2020YFA0112300)、國家自然科學(xué)基金(81972458,82103092)、廈門細(xì)胞治療研究項目(3502Z20214001)、福建省自然科學(xué)基金項目(2022J05312)、福建省健康教育聯(lián)合研究項目(2019-WJ-34)和" 111計劃"由國家外國專家局和教育部主辦(B06016)的資助。
論文鏈接:https://doi.org/10.1002/biot.202300207