近幾十年來(lái)，由病原體百日咳桿菌（BP）、流感病毒、SARS-CoV-2等引起的呼吸道傳染病嚴(yán)重威脅著人類健康，尤其是2019年爆發(fā)的2019年冠狀病毒?。ㄐ鹿诜窝祝：怂岬目焖?、早期和準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷、治療方案的評(píng)估、預(yù)防措施的制定、耐藥性的評(píng)估等具有重要意義，這反過(guò)來(lái)可以防止疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

CRISPR自問(wèn)世以來(lái)因其快速、敏感、特異性強(qiáng)、反應(yīng)恒溫等特點(diǎn)，被廣泛的用于分子診斷，如張鋒團(tuán)隊(duì)建立的SHERLOCK核酸檢測(cè)平臺(tái)、Jennifer 團(tuán)隊(duì)建立的DETECTR檢測(cè)技術(shù)等。然而，這些基于CRISPR/Cas的檢測(cè)策略，crRNA的設(shè)計(jì)受到原間隔物相鄰基序位點(diǎn)（PAM）序列限制，且通常需要分步驟進(jìn)行，要求首先對(duì)核酸進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行核酸檢測(cè)，這種多步驟反應(yīng)方法不僅麻煩且耗時(shí)，而且容易受到氣溶膠污染的影響。為了避免開(kāi)蓋污染這個(gè)問(wèn)題，李博安團(tuán)隊(duì)前期將CRISPR技術(shù)與微流控芯片結(jié)合，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)自動(dòng)化，避免了額外的移液步驟（(Sun et al., Science China-Chemistry，2022）。近期，研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)一步的研究中開(kāi)發(fā)了一種不受PAM限制的一步法核酸檢測(cè)技術(shù)，恒溫?cái)U(kuò)增與基因編輯檢測(cè)在同一個(gè)反應(yīng)管里進(jìn)行，無(wú)需產(chǎn)物轉(zhuǎn)移步驟，簡(jiǎn)單方便且敏感度高，該研究成果以題為“Fast and visual detection of nucleic acids using a one-step RPA-CRISPR detection (ORCD) system unrestricted by the PAM”的研究論文在線發(fā)表于ANALYTICA CHIMICA ACTA。

該研究通過(guò)對(duì)CRISPR/Cas12a識(shí)別PAM和非PAM靶標(biāo)的切割活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與識(shí)別PAM靶標(biāo)對(duì)比，Cas12a識(shí)別非PAM靶標(biāo)的cis切割靶標(biāo)模版的能力明顯變?nèi)?，?/span>trans切割單鏈DNA探針的能力保持不變。研究團(tuán)隊(duì)隨即將CRISPR/Cas12a與RPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合，一步法檢測(cè)64種隨機(jī)的PAM（TTTN）靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在一步CRISPR檢測(cè)中，最優(yōu)選的PAM序列TTT和含有兩個(gè)T（TTN、NTT、TNT）的靶標(biāo)在ORCD中表現(xiàn)出較差的性能，而TCC、TCG、CCT、CTC、GTC和CTG在ORCD上表現(xiàn)出優(yōu)異的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，降低CRISPR/Cas12a的cis切割活性，使CRISPR一步檢測(cè)PAM靶標(biāo)的敏感度提高了1000倍，意味著cis切割活性是CRISPR一步法檢測(cè)的關(guān)鍵。

采用非PAM序列，CRISPR一步法檢測(cè)速度快且敏感度高特異性強(qiáng)，30分鐘之內(nèi)能實(shí)現(xiàn)單拷貝的DNA和RNA檢測(cè)。并且與核酸免提取技術(shù)結(jié)合，ORCD系統(tǒng)可在30分鐘內(nèi)完成提取、擴(kuò)增和檢測(cè)樣本，在臨床應(yīng)用上檢測(cè)了82例百日咳博德特氏菌臨床樣本，與PCR相比，靈敏度和特異性分別為97.30%和100%。此外，RT-ORCD檢測(cè)了13例SARS-CoV-2樣本，結(jié)果與RT–PCR一致。并且僅用便攜式紫外燈或藍(lán)光燈照射即可觀察到結(jié)果。這種不受PAM限制、一步、快速、結(jié)果可視化、高敏感度和特異性的核酸檢測(cè)方法，在后疫情時(shí)代的POCT分子診斷的未來(lái)發(fā)展中顯示出巨大的潛力。它可以廣泛用于在非專業(yè)環(huán)境中快速檢測(cè)傳染病，例如小型診所、機(jī)場(chǎng)、田野和其他地方。

該論文的第一作者為廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生林康鳳，博士生郭劍光和碩士生郭祥舉為本文的共同第一作者，廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授、廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院張睿博士和廈門市婦幼保健院吳謹(jǐn)準(zhǔn)教授為該文章的共同通訊作者。本項(xiàng)目得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2020YFA0112300）、國(guó)家自然科學(xué)基金（81972458，32071150）、福建省健康教育聯(lián)合研究項(xiàng)目（2019-WJ-34）的資助。

論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340938

（圖/文 李博安團(tuán)隊(duì)）